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3種脫鈣液的骨組織脫鈣效果比較分析

時間:2018-04-09 14:06作者:羽沫
本文導讀:這是一篇關于3種脫鈣液的骨組織脫鈣效果比較分析的文章,改良Jenkins脫鈣液對組織損傷較小, 脫鈣效果充分, 適當縮短脫鈣時間, 切片染色質量上乘, 可以作為一種相對理想的骨組織脫鈣劑推廣應用。

  論文題目:3種脫鈣液的骨組織脫鈣效果比較分析

  摘要:目的 比較不同的脫鈣液對骨組織的脫鈣能力和脫鈣后HE染色效果, 尋找一種最佳的骨組織脫鈣方法。方法 通過查閱文獻資料, 把文獻報道的3種相對較理想的脫鈣液用于臨床病理骨組織脫鈣中, 對比3種脫鈣液對骨和骨髓組織常規病理切片質量和HE染色效果。結果 3種脫鈣液脫鈣時間的比較, 甲酸-甲醛脫鈣液>改良Jenkins脫鈣液>硝酸-甲醛脫鈣液。3種脫鈣液脫鈣效果的比較, 硝酸-甲醛脫鈣液>改良Jenkins脫鈣液>甲酸-甲醛脫鈣液。3種脫鈣液對組織損傷的比較, 硝酸-甲醛脫鈣液>甲酸-甲醛脫鈣液>改良Jenkins脫鈣液。結論 改良Jenkins脫鈣液對組織損傷較小, 脫鈣效果充分, 適當縮短脫鈣時間, 切片染色質量上乘, 可以作為一種相對理想的骨組織脫鈣劑推廣應用。

  關鍵詞:骨組織; 脫鈣方法; 改良Jenkins脫鈣液; 硝酸; 甲酸;

  骨組織是由黏多糖和一些蛋白質纖維構成的骨樣組織和沉著于其中的無機鹽形成的, 是一種堅硬的結締組織, 包括細胞及細胞外基質。細胞隨其發育階段可分為骨祖細胞、骨母細胞、骨細胞、破骨細胞[1], 細胞外基質包括有機物和無機物, 有機物中包括膠原纖維和無定形基質, 無機物中主要為骨鹽。脫鈣是應用化學或物理化學的方法將骨組織成分中的鈣鹽與膠原纖維分離, 棄去鈣鹽[2], 保留完整有機成分的一種方法。脫鈣方法與脫鈣液的選擇與骨組織切片的制作質量有著密切的關系。骨組織在制片前必須用脫鈣液將組織中的鈣鹽除去, 才能制成4~5μm厚的切片[3]。如果脫鈣不完全, 切片時不僅損壞刀刃, 而且染色時組織易出現脫片等現象[4]。如果脫鈣過度, 會破壞組織結構, 使組織抗原丟失, 嚴重影響對送檢標本的臨床病理診斷[5], 因此選擇合適的脫鈣方法很有必要。脫鈣液有無機酸 (硝酸、鹽酸、硫酸) 和有機酸 (醋酸、甲酸) 兩大類[6], 脫鈣液是決定骨骼組織切片質量、染色效果的關鍵[7]。目前在臨床病理脫鈣中, 有3種脫鈣液較理想, 本研究通過比較3種脫鈣液的脫鈣效果和染色制片質量, 旨在選擇一種最好的脫鈣方法應用于臨床骨組織脫鈣。

  1 資料與方法

  1.1 一般資料

  選取本院送檢的骨腫瘤、病變骨及鈣化組織標本15例, 組織離體后即用10%中性緩沖甲醛溶液充分固定12~24h。

  1.2 試劑及儀器

  濃鹽酸、硝酸、無水乙醇購自廣東汕頭西隴化工股份有限公司;甲酸、氯仿、蘇木素、伊紅、中性樹膠購自珠海Baso公司;冰醋酸、二甲苯、甲醛購自武漢市中天化工有限公司。常州中威TSJ-QX型全自動封閉式組織脫水機, WB-3000型包埋機, 徠卡2235型切片機。

  1.3 試劑配制

  (1) 改良Jenkins混合溶液:濃鹽酸5mL, 冰醋酸5mL, 氯仿10mL, 無水乙醇70mL, 10%中性緩沖甲醛10mL。 (2) 硝酸-甲醛液:甲醛10mL, 蒸餾水90mL, 純硝酸20mL。 (3) 甲酸-甲醛液:甲酸15mL, 甲醛5mL, 蒸餾水80mL。 (4) 10%中性緩沖甲醛液的配制:蒸餾水1 000 mL, 37%的甲醛溶液100 mL, 磷酸二氫鈉4 g, 磷酸氫二鈉6.5g, 用1mol/L氫氧化鈉調整pH至7.2~7.4。

  1.4 方法

  (1) 固定。組織要求及時充分固定, 大塊骨組織應鋸開固定, 用中性緩沖甲醛液固定時間不少于12~24h。 (2) 取材。骨髓穿刺標本一般長約1cm、直徑0.05~0.1cm, 不需修塊, 可直接用濾紙包好脫鈣。大塊的骨腫瘤、病變骨、鈣化組織根據標本的不同用骨鉗或骨鋸處理成1.5cm×1.0cm×0.2cm的骨組織塊。 (3) 脫鈣及終點判斷。 (1) 物理方法:隨時觀察脫鈣情況, 當組織塊呈半透明狀浮在液面上, 手指按壓柔軟有彈性, 用大頭針可輕松刺入骨皮質表示脫鈣完全。 (2) 化學方法:用吸管取脫鈣液1mL, 加10%草酸鉀1mL搖勻, 以草酸鹽結晶不析出為脫鈣終點。 (4) 脫鈣后的除酸處理。脫鈣完全后, 標本用流水沖洗5min, 碳酸鋰飽和水溶液5min, 沖洗3次;再流水沖洗10min, 即可進行常規脫水, 染色時適當延長組織在蘇木素中的時間, 而在伊紅停留的時間適當縮短, 這樣可以得到更好的對比度。

  1.5 觀察指標

  骨組織脫鈣時間、骨組織、HE染色效果。

  2 結果

  經上述方法比較得出:骨組織塊經改良Jenkins液常溫脫鈣4d左右脫鈣完全, 組織損傷小, 常規制片效果好, 切片平坦, 薄厚均勻, 鏡下見組織結構完整, 無皺縮、龜裂現象, 細胞核呈藍色, 骨基質、纖維、軟骨呈不同程度的紅色, 色澤鮮艷, 對比度好。骨組織塊在甲酸-甲醛脫鈣液中72~120h脫鈣完全, 組織損傷較小, 切片結構完整, 染色鮮艷均勻, 對比度較好。骨組織塊在硝酸-甲醛脫鈣液中48~60h到達脫鈣終點, 肉眼見組織稍發泡腫脹, 顏色淡黃, 切片容易出現刀痕;鏡下見組織結構欠完整, 胞核淡染著色弱, 對比度欠佳。3種脫鈣液脫鈣時間的比較, 甲酸-甲醛脫鈣液>改良Jenkins脫鈣液>硝酸-甲醛脫鈣液。3種脫鈣液脫鈣效果的比較, 硝酸-甲醛脫鈣液>改良Jenkins脫鈣液>甲酸-甲醛脫鈣液。3種脫鈣液對組織損傷的比較, 硝酸-甲醛脫鈣液>甲酸-甲醛脫鈣液>改良Jenkins脫鈣液。

  3 討論

  脫鈣是骨組織制片中的必要環節, 如若脫鈣不徹底, 則組織切片困難, 染色時易脫片, 鏡下觀察骨組織結構模糊, 胞核皺縮, 部分區域折疊卷曲, 影響病理診斷的及時性和準確性[8]。尋找簡便、快捷、有效的脫鈣方法是骨組織病理學研究的重要課題之一。結合多年骨組織脫鈣經驗, 筆者認為以下方面值得關注。

  3.1骨組織的固定

  骨組織及時、充分的固定不僅能保存良好的骨組織形態結構, 而且能防止組織自溶腐敗, 阻止細胞內外的酶對蛋白質的分解作用、保存組織細胞的抗原性[9]。脫鈣液中的酸對骨組織有不同程度的損傷, 未固定的組織在酸性脫鈣液中受到的損傷比已固定的組織大3倍, 所以骨組織必須先固定后脫鈣, 或脫鈣與固定同時進行, 未經固定的骨組織不宜脫鈣。

  3.2 脫鈣時應權衡的因素

  (1) 盡量減少脫鈣液對組織和細胞成分的損傷, 保護組織微細結構。 (2) 能充分去除鈣質, 又不影響后續HE和IHC染色。 (3) 脫鈣方法簡單, 試劑價廉易得, 適當兼顧脫鈣時間[10]。

  3.3脫鈣后的中和酸處理

  常規硝酸脫鈣后的組織一般需要流水沖洗10~12h, 費時又不環保, 本文脫鈣到達終點后先流水沖洗5min, 然后飽和碳酸鋰水溶液處理5min×3次, 再流水沖洗10min, 只需短短30min即完成整個除酸過程。具有以下優點:由于飽和碳酸鋰水溶液是一種弱堿液, 能很快滲入到組織細胞中中和酸, 大大縮短了流水洗滌時間, 經此改進除酸方法制成的切片對蘇木素嗜染性強, 效果穩定。

  3.4 脫鈣液的選擇

  本科室近年來一直采用10%硝酸脫鈣, 主要是因為其脫鈣能力強, 脫鈣時間短, 但這也使骨組織的脫鈣程度較難掌握, 容易過脫, 對組織造成損傷。硝酸在脫鈣過程中會產生二氧化碳, 氣泡從組織中溢出會使結締組織分離[11], 破壞組織結構。另外, 硝酸處理組織后染色效果差, 胞核不著色或著色淺, 不均勻, 對比度欠佳。甲酸又名蟻酸, 其脫鈣速度比硝酸慢, 破壞組織的程度比硝酸輕, 但脫鈣時間稍長, 疏松骨片需脫鈣48h, 致密骨片需4~5d, 其中每3d需更換新液1次[1]。所以迫切需要尋找好的脫鈣方法取而代之。通過查閱文獻, 綜合比較文獻介紹的較為理想的3種脫鈣方法, 發現Jenkins復合脫鈣液棄硝酸而選用鹽酸, 對組織損傷小, 不會使組織膨脹, 而是使組織略有收縮。骨組織塊經此液脫鈣后, 切片完整, 平坦均勻, 無返砂現象。不足之處同樣在于組織處理時間過長, 脫鈣完全約需要7d左右。2015年初本科室摸索改良Jenkins原配方, 爭取縮短脫鈣時間, 實驗中把鹽酸的量由原來的4mL增加為5mL, 冰醋酸由原來的3mL也增加為5mL, 無水乙醇由原來的73 mL降為70 mL, 氯仿及甲醛劑量不變, 經過近50例骨組織塊脫鈣觀察, 組織處理時間大為縮短, 骨密度高的如股骨組織塊常溫下72h即可徹底脫鈣, 骨密度較低的骨松質36~48h也能脫鈣完全, 若加急則可以將脫鈣液放入37℃恒溫箱中, 骨組織塊24h左右即達到脫鈣要求。此組合脫鈣液中鹽酸為強酸, 增加鹽酸用量旨在加快脫鈣時間, 同時又擔心影響細胞核的著色, 實際操作中觀察發現, 通過改善除酸方式, 鹽酸與生理鹽水和氯仿混合后對細胞核的著色影響甚微, 鹽酸除了加快脫鈣速度, 還有使組織略收縮的功效, 降低了冰醋酸對組織膨脹的影響[12]。由于骨組織的致密性, 固定劑的選用要求具有強的穿透力, Jenkins復合脫鈣液選用中性甲醛, 甲醛具有穿透速度快、固定均勻、對組織收縮較小的特點, 使得脫鈣液不但具有脫鈣作用, 同時兼具較好的固定作用。冰醋酸具有在固定時穿透速度快, 且有防止組織自溶變性的特點, 同時還能使組織略膨脹, 稍加量即可抵消鹽酸及甲醛引起的組織收縮和硬化[13]。骨組織在改良Jenkins液脫鈣徹底后切片光滑細膩, 厚度可達4mm, 骨與骨周圍組織形態保持完整, 骨髓腔內的細胞清晰可見, 胞質、胞核及骨小梁著色均勻, 色彩鮮艷, 對比度強, 能較好地顯示骨組織的各種結構, 是一種較理想的用于臨床病理工作的脫鈣方法。

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